Le Bordeaux Imaging Center, situé sur le campus de Carreire, utilise depuis 2002 les lasers pour l'imagerie cellulaire du vivant. Grâce à ces technologies, les chercheurs disposent d’outils permettant une analyse à l’échelle moléculaire de phénomènes biologiques.


Identifier précisément des protéines

 

L’étude des protéines dans les tissus est permise, en microscopie photonique, si elles sont marquées avec une étiquette fluorescente. Soumise à une longueur d’onde spécifique, le marqueur fluorescent associé à la protéine à étudier répondra en émettant une émission de fluorescence. En captant cette émission de fluorescence, il devient alors possible de suivre en temps réel le comportement de ladite protéine.

 

 

Les échantillons biologiques (cellules, tissus,…) sont donc préparés en amont pour être rendus fluorescents, c'est-à-dire pour réagir à une longueur d'onde définie. En marquant au préalable une protéine particulière, on pourra donc facilement étudier sa localisation, son comportement, sa trajectoire.

 

Mieux, en utilisant plusieurs rayons différents (ayant des longueurs d'onde différentes), il est possible d’étudier en temps réel plusieurs protéines différentes, de les colocaliser, au sein d’une même cellule.

 

Le marquage des protéines peut se faire de plusieurs manières :

  • Par virus : un virus fluorescent est injecté, qui vient produire des protéines fluorescentes  à étudier.
  • Transfection sur cellule : il s’agit d’incorporer de l’ADN codant pour une protéine d'intérêt pour que, lorsque la cellule produit telle ou telle protéine qu’on souhaite étudier, elle soit associée à un « marqueur fluorescent ».
  • Immunomarquage : on utilise des anticorps fluorescents qui vont se fixer sur la protéine à étudier.

Étudier un plan sans couper

 

Grâce au laser, il est possible d’étudier des protéines dans un tissu de cellules grâce à plusieurs techniques.


Les lasers sont utilisés en microscopie confocale.  Cette technique  permet de visualiser de la fluorescence dans un tissu de cellules de manière nette sur chaque plan de profondeur. L'épaisseur de l'échantillon dans ce cas peut atteindre plusieurs dizaines de µm. En photonique plein champ, la fluorescence des autres couches de tissu interfèrent et dégrade la visualisation et donc parasite l’image. Grâce au laser utilisé en microscopie confocale, il est possible, en filtrant le signal de sortie par un trou d'aiguille de ne conserver que l'information qui provient des autres plans. C’est comme si, sur un appareil photo, on ne gardait que le plan de focale, c'est-à-dire la partie nette de l’image, et qu’on oubliait les parties floues, qui ne sont pas sur le même plan. Ainsi, sur un tissus épais, il n’y a plus de  parasite, et on peut étudier précisément le plan que l’on veut.


Plus encore, avec la microscopie multiphotonique, l'utilisation de laser infra-rouge permet d'obtenir des résultats similaires, sans la nécessité d'utiliser de trou d'aiguille, car cette fois l'excitation de l'échantillon ne se fait que sur le plan focal. De plus, la nature infra-rouge du laser permet de descendre encore plus profondément dans les tissus, avec un rapport signal/bruit amélioré.  

 

Avec la technique d'imagerie par feuillet de lumière, on envoie le laser à travers des optiques qui transforment le rayon lumineux en une feuille de lumière. Cette feuille est envoyée dans un tissu entier éclairci, et on peut ainsi l'imager dans son ensemble en le sectionnant otpiquement. Cela permet d’obtenir une coupe d’un cerveau par exemple sans avoir besoin de le couper effectivement.

 

Une image précise à l'échelle de la molécule

 

La plupart des techniques de microscopie photonique décrites précédemment et utilisant des lasers se basent sur l’intensité de la fluorescence. Pourtant, il est aussi possible de mesurer la durée de vie de fluorescence, c'est-à-dire le temps de résidence des photons à l’état excité. Selon l’état de l’environnement, la durée de vie ne sera pas la même. Cela renseigne sur l’environnement de la molécule fluorescente. Par exemple, s'il y a interaction entre deux molécules fluorescentes, la durée de vie sera modifiée. Par cette technique, on peut cartographier les interactions moléculaires au sein d'une cellule.

Une synapse vue à gauche, par photoluminescence classique, à droite, en super-résolution.
Une synapse vue à gauche, par photoluminescence classique, à droite, en super-résolution.

Les techniques de super-résolution comme le STORM vont encore plus loin. Elles sont basées sur la détection de molécules individuelles. Dans ce cas, il s’agit de faire passer les molécules fluorescentes dans un « état noir » (grâce à un laser). Elles vont ensuite revenir aléatoirement dans l’état initial, en libérant un photon. Ce qui est intéressant, c’est qu’elles y retombent pratiquement « unes par unes », réparties dans le temps. En prenant un grand nombre d’images (de l’ordre de 80 000) à haute fréquence, on image les molécules de manière distincte. Au lieu de les avoir toutes d’un coup, en cohue donc floues, elles viennent chacune leur tour, ce qui permet de les localiser avec une grande précision. Les 80 000 images initiales sont ensuite regroupées, ce qui permet d’obtenir une image finale de haute résolution.